Liebe Mikrobe

Seit Pasteur ist bekannt, dass der menschliche Gastrointestinaltrakt im Wesentlichen ein Fließbioreaktor ist, in dem viele Mikroorganismen leben. Die Einstellung der Wissenschaftler zur Darmflora hat sich in dieser Zeit radikal verändert. Vor hundert Jahren bot der große Ilya Mechnikov, der Begründer der modernen Immunitätstheorie, für deren Schaffung er den Nobelpreis erhielt (für zwei Personen mit seinem unerbittlichen Gegner, nicht weniger großen Paul Ehrlich), sogar an, den Dickdarm als eine der Möglichkeiten zu verlängern, das Leben zu verlängern. Und denen, denen diese Maßnahme zu radikal erschien, empfahl ich, möglichst viel Kefir zu trinken, um schädliche, seiner Meinung nach, Mikroben mit nützlichen Milchsäurebakterien zu unterdrücken. Nach einem halben Jahrhundert hat sich der Kurs um 180 Grad geändert. Es stellte sich heraus, dass die normale Darmflora sowie die Haut und die Schleimhäute viele nützliche Funktionen ausüben - zum Beispiel unterdrückt sie die Vitalaktivität pathogener Mikroorganismen, die den Körper ständig angreifen. In den letzten Jahren sind die mutigsten Mikrobiologen sogar noch weiter gegangen und haben den Menschen und seine Mikroben zu einem einzigen symbiotischen Superorganismus erklärt.

Die Entwicklung molekularbiologischer Methoden brachte die Wissenschaftler auf eine neue Ebene, um die Prozesse der Symbiose des Menschen und seiner Mikroflora zu verstehen, die gut erforscht zu sein schienen und von deren Untersuchung keine besonderen Überraschungen erwartet wurden. Das schnelle Wachstum der Geschwindigkeit und der Rückgang der Kosten für DNA-Sequenzierungsmethoden (Bestimmung der Nukleotidsequenz) und die parallele Zunahme der Leistungsfähigkeit von Personalcomputern und die Entwicklung des Internets ermöglichten die Analyse von Informationen über große Bereiche des Genoms. Nach der Entschlüsselung der Chromosomen von Hunderten von einzelnen Bakterienarten hat sich in der Genetik von Mikroorganismen ein neuer Ansatz entwickelt - der Populationsansatz: Die Gene aller Bakterien, die in einem bestimmten Gebiet auf einmal leben, werden analysiert. Natürlich erwies sich die Population des „menschlichen Bioreaktors“ als eine der wichtigsten für die Untersuchung von mikrobiellen Populationen.

Die erste Arbeit, die zu einem neuen Blick auf die intestinale Mikrobiota führte, wurde 1999 von einer Gruppe von Wissenschaftlern des National Institute for Agronomic Research (Frankreich) und der University of Reading (Vereinigtes Königreich) veröffentlicht. Die Autoren beschlossen, die Methode der Sequenzierung von 16S-RNA-Genen für die Untersuchung der mikrobiellen Population des Darms anzuwenden.

16S RNA - Bakterien ID

Der erste und notwendige Schritt bei der Bestimmung von Mikroorganismen war seit Pasteur die Kultivierung auf Nährmedien. Aber viele wichtige (und nützliche und pathogene) Mikroben möchten in keinem Medium wachsen. Es war möglich, bisher unzugängliche, unkultivierte Bakterien zu untersuchen und eine Ordnung in der extrem verworrenen Systematik bereits bekannter Prokaryonten mit der Entwicklung der Bioinformatik und der Entstehung moderner Methoden der Molekularbiologie - Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - zu etablieren, die es ermöglicht, Millionen und Milliarden exakter Kopien aus einem einzigen DNA-Segment zu erhalten unter Verwendung von PCR-Genen in bakteriellen Plasmiden und Sequenzierungstechniken für Nukleotidsequenzen, die als Ergebnis all dies für ana ausreichend sind Iza Menge.

Ein idealer Marker für die Identifizierung von Mikroorganismen war das Gen, das für 16S ribosomale RNA kodiert (jede der beiden Untereinheiten des Ribosoms - Zellworkshops für die Proteinsynthese - besteht aus miteinander verflochtenen Proteinmolekülen und Ketten von Ribonukleinsäuren).

Dieses Gen ist im Genom aller bekannten Bakterien und Archaeen, aber es fehlt in Eukaryoten und Viren, und wenn Sie seine charakteristische Nukleotidsequenz gefunden haben, handelt es sich definitiv um die Gene von Prokaryoten. (Um genau zu sein, das 16S-RNA-Gen existiert auch in Eukaryoten, aber nicht in nuklearen Chromosomen, sondern in mitochondrialen Chromosomen. Dies bestätigt erneut, dass Mitochondrien entfernte Nachkommen von Symbiontenbakterien der ersten eukaryotischen Organismen sind.)

Dieses Gen hat sowohl konservative Regionen, die für alle Prokaryoten gleich sind, als auch artspezifisch. Konservative Stellen dienen für die erste Stufe der Polymerasekettenreaktion - das Anbringen der Test-DNA an die Primer (Saatstellen der DNA, an die sich die untersuchte Nukleotidkette anfügen muss, um den Rest der Sequenz zu analysieren) und speziesspezifisch - um die Spezies zu bestimmen. Darüber hinaus spiegelt der Ähnlichkeitsgrad artenspezifischer Parzellen sehr gut die evolutionäre Verwandtschaft verschiedener Arten wider.

Ein weiterer Bonus ist, dass Sie für die Klonierung und nachfolgende Analyse ribosomale RNA selbst verwenden können, die in einer Zelle in einer viel größeren Menge vorhanden ist als das entsprechende Gen. Nur Sie müssen es zuerst mit einem speziellen Enzym - der reversen Transkriptase - in DNA "überschreiben".

Die 16S-RNA-Nukleotidsequenzen aller bekannten Bakterien und Archaeen (etwa 10.000 Arten) sind weithin verfügbar. Die identifizierten Sequenzen werden mit denen in den Datenbanken verglichen, um die Art der Bakterien genau zu identifizieren oder für die nächste nicht kultivierte Art zu erklären.

In letzter Zeit wurde die alte phänotypische Klassifizierung von Bakterien auf der Grundlage schlecht formalisierter Kriterien intensiv überarbeitet - vom Auftreten der Kolonien bis hin zu Lebensmittelpräferenzen und der Fähigkeit, mit verschiedenen Farbstoffen angefärbt zu werden. Die neue Systematik basiert auf molekularen Kriterien (16S-RNA) und wiederholt nur teilweise die phänotypische.

Die kodierenden Sequenzen der 16S-RNA mittels PCR wurden direkt aus der "Umgebung" extrahiert - 125 Milligramm des Menschen, entschuldigen Sie mich, Stuhl, wurde in Plasmide von Escherichia coli eingefügt (nicht weil es intestinal ist, sondern weil Escherichia coli eines der beliebtesten Arbeitstiere von Molekularbiologen ist.) ) und erneut aus der Kultur der vermehrten Bakterien isoliert. So wurde die 16S-RNA-Genbank aller Mikroorganismen in der Probe erstellt. Danach wurden 284 Klone zufällig ausgewählt und sequenziert. Es stellte sich heraus, dass nur 24% der erhaltenen 16S-RNA-Sequenzen zu vorbekannten Mikroorganismen gehörten. Seit mehr als hundert Jahren haben drei Viertel der Mikroflora im Darm jedes Menschen die Aufmerksamkeit der mit den Methoden der klassischen Mikrobiologie bewaffneten Forscher umgangen! Die Wissenschaftler konnten die Bedingungen für die Kultivierung dieser Bakterien einfach nicht finden, weil die launischsten Bewohner des Darms es ablehnten, auf traditionellen mikrobiologischen Medien zu wachsen.

Heute wurde mit molekularen Methoden festgestellt, dass 10 von 70 großen Bakterien-Taxa in der Mikrobiota eines Erwachsenen vertreten sind. Etwa 90% unserer Mikroben gehören zu den Firmicutes-Typen (z. B. sind die bekannten Laktobakterien die Hauptverursacher der Milchsäuerung) und Bacteroidetes sind obligatorische Anaerobier (Organismen, die nur unter Ausschluss von Sauerstoff leben können), die häufig als Indikator für Verschmutzung verwendet werden natürliches Wasser Abwasser. Die restlichen 10% der Bevölkerung teilen sich Proteobacteria taxa (dazu gehören unter anderem E. coli), Actinobacteria (einer der Arten von Actinomyceten war das isolierte Antibiotikum Streptomycin), Fusobacteria (normale Bewohner der Mundhöhle und eine häufige Ursache für Parodontitis), Verrucomicrobia (kürzlich) Es wurde festgestellt, dass eine geothermische Quelle eine Art dieser Mikroben ist, die sich von Methan ernähren, das aufgrund der vitalen Aktivität anderer Mikroorganismen im Darm reichlich vorhanden ist.) Cyanobakterien (sie werden oft noch als alter Name "Blaugrünalgen" bezeichnet), Spirochaeaten ( Tew, nicht blass), Synergistes und VadinBE97 (welche Art von Tieren sind diese, fragen die Schöpfer der neuen prokaryotischen Systematik).

Trotz der Tatsache, dass die Artenzusammensetzung der Darmmikroorganismen eher eintönig ist, kann das Mengenverhältnis von Vertretern bestimmter systematischer Gruppen in den Mikrobiota verschiedener Menschen stark variieren. Aber wie sieht die normale Darmflora aus und wie werden sie gebildet?

Diese Frage wurde 2007 in einer Arbeit einer Gruppe amerikanischer Biologen unter der Leitung von Patrick Brown von der Stanford University beantwortet. Sie haben die Entstehung von Mikrobiota bei 14 Neugeborenen im ersten Lebensjahr verfolgt. Die Autoren konnten mehrere Quellen der Kolonisation des Gastrointestinaltrakts feststellen. Die Mikrobiota der Babys hatten Ähnlichkeiten mit der Mikroflora der Mutter: Vaginal-, Fäkalien- oder Mikroflora von Muttermilchproben. Je nach Besiedlungsquelle waren im ersten Lebensjahr verschiedene Arten in der Darmflora von Säuglingen vorherrschend. Diese Unterschiede blieben während des gesamten Untersuchungszeitraums signifikant, aber im Alter von einem Jahr machte sich die Bildung der Mikrobiota für Erwachsene bemerkbar. Interessante Daten wurden am Beispiel eines Zwillingspaares gewonnen. Die Mikroflora in ihnen war in ihrer Zusammensetzung fast identisch und änderte sich auf dieselbe Weise. Dieser Befund zeigte die enorme Rolle der menschlichen Komponente des Mikrobiota-Wirts-Paares bei der Bildung der Darmflora-Population. Für die Reinheit des Experiments wäre es natürlich notwendig, die Babys noch im Krankenhaus zu trennen - eine großartige Geschichte für einen indischen Film! Im Laufe der Jahre lernen sie sich durch Analysen kennen... Aber die Daten aus anderen Arbeiten bestätigten die Annahme, dass die individuellen, einschließlich erblichen, Merkmale der menschlichen Biochemie einen großen Einfluss auf die Zusammensetzung ihrer Mikrobiota haben.

Mikrobiell in uns mehr als menschlich

Neben der Untersuchung bestimmter Arten von Darmmikroflora haben in den letzten Jahren viele Forscher bakterielles Metagen untersucht - eine Reihe von Genen aller Mikroorganismen in einer Probe des Inhalts des menschlichen Darms (entweder von der Haut ausgewaschen oder in einer Schlickprobe vom Meeresboden). Dazu verwenden sie die automatisiertesten, computergesteuertesten und leistungsfähigsten DNA-Sequenzierungstechnologien, mit denen kurze Sequenzen von Nukleotiden analysiert werden können, an den Enden dieser Abschnitte ein Puzzle aus mehreren übereinstimmenden Buchstaben zusammengesetzt werden, dieses Verfahren viele Male für jedes Stück des Genoms wiederholen und die Dekodierung einzelner Gene und Chromosomen schnell durchführen Bis zu 14 Millionen Nukleotide pro Stunde - Größenordnungen schneller als noch vor wenigen Jahren. So wurde festgestellt, dass die Mikrobiota des menschlichen Darms etwa 100 Billionen Bakterienzellen aufweist - etwa zehnmal mehr als die Gesamtzahl der Zellen im Wirtskörper. Die Menge der Gene, aus denen das bakterielle Metagenom besteht, ist ungefähr 100-mal größer als die Menge der Gene des menschlichen Körpers. Wenn wir über das Volumen biochemischer Reaktionen sprechen, die in der Mikrobenpopulation stattfinden, ist es wieder um ein Vielfaches höher als im menschlichen Körper. Der bakterielle „Reaktor“ implementiert metabolische Ketten im Organismus des Wirts, die er nicht selbst tragen kann - zum Beispiel die Synthese von Vitaminen und ihren Vorläufern, den Abbau bestimmter Toxine, den Abbau von Cellulose zu verdaulichen Polysacchariden (bei Wiederkäuern) usw.

Studien, die im Labor von Jeffrey Gordon (School of Medicine an der University of Washington, St. Louis, Missouri) durchgeführt wurden, erlaubten es, die Artenvielfalt der Bakterien des Magen-Darm-Trakts mit der Ernährung und den metabolischen Merkmalen des Individuums in Verbindung zu bringen. Die Ergebnisse des Experiments wurden in der Dezember-Ausgabe von Nature veröffentlicht. In dem einjährigen Experiment wurde vorgeschlagen, eine Korrelation zwischen dem Übergewicht beim Menschen und der Zusammensetzung der mikrobiellen Population des Darms herzustellen. Ein Dutzend dicke Leute, die sich einverstanden erklärten, ihren Bauch auf den Altar der Wissenschaft zu legen, wurden in zwei Gruppen aufgeteilt. Einer nahm eine fettarme Diät, der andere eine Low-Carb-Diät. Alle Freiwilligen nahmen an Gewicht ab und veränderten gleichzeitig das Verhältnis der beiden Hauptgruppen der Darmmikroorganismen: Die Anzahl der Firmicutes-Zellen nahm ab und die Anzahl der Bacteroidetes nahm dagegen zu. Bei einer fettarmen Diät machte sich eine solche Änderung später bemerkbar - nachdem die Patienten 6% ihres Gewichts verloren hatten, und bei einer kohlenhydratarmen Diät - nachdem die ersten Kilogramm (2% ihres ursprünglichen Körpergewichts) abgenommen hatten. In diesem Fall war die Änderung der Zusammensetzung der Mikroflora um so ausgeprägter, je geringer das Gewicht der Versuchsteilnehmer wurde.

Parallel dazu wurden im selben Labor Experimente mit Labormäusen durchgeführt, die eine Mutation im Gen für Leptin, das "Sättigungshormon", tragen, ein Protein, das in den Zellen des Fettgewebes synthetisiert wird und zur Bildung eines Sättigungsgefühls beiträgt. Mäuse, die beide Kopien dieses Gens beschädigt haben (diese Mutation wird durch den Lep ob-Index angezeigt), fressen 70% mehr als der Wildtyp, mit allen daraus folgenden Konsequenzen. Und der Gehalt von Firmicutes in ihrem Darm ist anderthalb Mal höher als der von heterozygoten Linien mit nur einem defekten Allel (ob / +) und homozygot für das normale Gen der Wildtyplinien (+ / +).

Den Einfluss der Mikroflora auf den Stoffwechsel ihres "Inhabers" überprüften die Forscher an einem anderen Modell - den Gnotobioticheskimi-Mäusen.

Solche Tiere, die seit ihrer Geburt in sterilen Kammern leben und in ihrem Leben noch nie eine einzige Mikrobe getroffen haben, werden in der biomedizinischen Forschung nicht häufig verwendet. Absolute Unfruchtbarkeit in der Muskulatur, bei Kaninchen und vor allem beim Ziegenstall - ist teuer und mühsam, und nach dem Treffen mit der ersten Mikrobe oder dem Virus sterben die armen Kreaturen entweder oder werden für weitere Experimente ungeeignet. Was in gnotobiotov mit dem Immunsystem passiert, ist eine andere Geschichte, und sie essen zu dritt und gleichzeitig - Haut und Knochen aufgrund des Fehlens einer mikrobiellen Komponente der Verdauung.

Nach der Transplantation der Mikroflora von fettleibigen (ob / ob) Spendern verdickte sich die Gnatobiot-Maus in zwei Wochen um fast eineinhalbfach (47%). Diejenigen, die mit Mikroflora von Wildtyp (+ / +) - Spendern mit normalem Gewicht "ausgesät" wurden, erholten sich nur um 27%.

Die Ergebnisse weiterer Studien zu Veränderungen im symbiotischen Maus-Mikrobenorganismus bestätigten die Hypothese, dass die Mikrobiota von adipösen Individuen zu einer tieferen Verarbeitung von Nahrungsmitteln beiträgt. Ein Vergleich von Stuhl-DNA-Proben aus fettleibigen und normalen Mäusen hat gezeigt, dass Fettleibigkeitsmikrobiome mit Enzymgenen gesättigt sind, die einen effizienteren Abbau von Polysacchariden ermöglichen. Der Darm von fetten Mäusen enthielt große Mengen an Fermentationsendprodukten - Verbindungen von Essigsäure und Buttersäure, was auf eine tiefere Verarbeitung von Nahrungsbestandteilen hindeutet. Kalorimetrisch (vom Wort „Kalorien“!) Die Analyse der Stuhlproben bestätigte dies: Der Stuhl von ob / ob-Mäusen enthielt weniger Kalorien als Wildtyp-Mäuse, die keine Energie aus der Nahrung absorbierten.

Zusätzlich zu den wichtigen Informationen über die „mikrobielle“ Komponente der Fettleibigkeit konnten die Autoren die grundlegende Ähnlichkeit von Mikroflora bei übergewichtigen Menschen und Mäusen aufzeigen, was neue Perspektiven eröffnet, um das Problem des Übergewichts zu untersuchen und möglicherweise dieses Problem durch „Transplantieren“ gesunder Mikroflora oder deren Bildung bei Patienten zu lösen fettleibig

Die Tatsache, dass die Mikrobiota den Stoffwechsel des Wirts steuern kann, ist nicht mehr zweifelhaft. Gordons Forschungen zu Übergewicht haben eine Brücke zur Behandlung von Stoffwechselkrankheiten gemacht, wie zum Beispiel der allgemeinen Erschöpfung, die Kinder in armen Ländern mit einem tropischen Klimamasmus von einem bis vier Jahren betrifft (dieses Wort hat nur eine sprachliche Beziehung zu Marasmus: griechischer Marasmos wörtlich bedeutet Erschöpfung, Aussterben) und Kwashiorkor (in der Sprache eines der Stämme Ghanas, Kwashiorkor - "roter Junge"). Das Auftreten von Krankheiten ist mit einem Mangel an Proteinen und Vitaminen während des Übergangs vom Stillen auf die Ernährung von Erwachsenen verbunden. Die Krankheit betrifft jedoch selektiv Kinder, deren Geschwister beim Übergang zur traditionellen Ernährung der Region keine Probleme hatten. Studien haben gezeigt, dass sich die Darmflora von kranken Kindern sehr stark von der Mikroflora ihrer Eltern sowie von der Mikroflora gesunder Brüder und Schwestern unterscheidet. Zunächst wurde das nahezu vollständige Fehlen von Bacteroidetes in der Darmpopulation und die Dominanz seltener Arten, die zu den Arten von Proteobakterien und Fusobakterien gehören, festgestellt. Nachdem kranke Kinder (vorsichtig, um nicht überdosiert zu werden!) Intensiv mit Protein gefüttert wurden, wurden ihre Mikrobiota ähnlich wie bei Verwandten, wobei Bacteroidetes und Firmicutes vorherrschten.

Neuere Studien haben nicht nur das derzeitige Verständnis der menschlichen Darmflora grundlegend verändert, sondern auch zur Entstehung eines Konzepts beigetragen, das die Darmmikrobiota als zusätzliches mehrzelliges "Organ" des menschlichen Körpers betrachtet. Ein Organ, das aus verschiedenen Zelllinien besteht, die sowohl untereinander als auch mit dem Wirtsorganismus kommunizieren können. Der Körper, der Energieflüsse umverteilt, wichtige physiologische Reaktionen durchführt, sich unter dem Einfluss der Umgebung verändert und sich selbst regeneriert, wenn Änderungen durch äußere Bedingungen hervorgerufen werden.

Die Fortsetzung des Studiums des "bakteriellen Organs" kann und sollte zu einem Verständnis der Funktionsgesetze, der Offenlegung seiner subtilen Verbindungen mit dem Wirtsorganismus und infolgedessen zur Entstehung neuer Methoden zur Bekämpfung menschlicher Erkrankungen durch gezielte Behandlung von Funktionsstörungen beider Komponenten des Metaorganismus führen.

Valery Poroiko, Ph.D.
Universität von Chicago, Abteilung für Allgemeine Chirurgie
Portal "Ewige Jugend" www.vechnayamolodost.ru

Journalversion des Artikels in Popular Mechanics Nr. 4-2008 veröffentlicht

Identifizierung von Bakterien durch Sequenzierung des 16S-Gens der ribosomalen RNA, Rolle und Ort der Methode bei der Diagnose bakterieller Infektionen Abgeschlossen: Saveliev. - Präsentation

Die Präsentation wurde vor 4 Jahren von Ludmila Shumikhina veröffentlicht

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Präsentation der 11. Klasse zum Thema: "Artenidentifizierung von Bakterien durch Sequenzierung des 16S-Gens der ribosomalen RNA, Rolle und Ort der Methode bei der Diagnose bakterieller Infektionen. Abgeschlossen: Saveliev." Kostenloser Download und ohne Registrierung. - Transkription:

1 Artenidentifizierung von Bakterien durch Sequenzierung des 16S-Gens von ribosomaler RNA, Rolle und Ort der Methode bei der Diagnose bakterieller Infektionen : Cand. Biol. Afonyushkin Vasily Nikolaevich PhD Biol. Afonyushkin Vasiliy Nikolaevich

2 Aufgaben: 1. Die Methode der DNA-Elektrophorese in Agarosegel beherrschen. 2. Die Methode zur Analyse der Sequenzierungsergebnisse beherrschen und die Nukleotidsequenzen von Fragmenten des 16 S-Gens der ribosomalen RNA der isolierten Isolate der Bacillus-Gattung bauen. 1. Die Methode der Elektrophorese der DNA im Agarosegel beherrschen. 2. Die Sequenzierungsmethode analysieren und führen die Konstruktion von Nukleotidsequenzen von Fragmenten des 16 S-Gens der ribosomalen RNA der erhaltenen Isolate der Gattung Bacillus 3 durch. Untersuchen Sie die Aussichten für die gemeinsame Verwendung von Sequenzierungsverfahren und Biochemie Identifizierung von Bakterien 3. Untersuchung der Aussichten für die gemeinsame Nutzung der Methoden zur Sequenzierung und biochemischen Identifizierung von Bakterien Ziel: Untersuchung der Möglichkeiten der Methode der spezifischen Identifizierung von Bakterien mithilfe der Sequenzierungsmethode des 16S-Gens der ribosomalen RNA in Kombination mit herkömmlichen Identifikationsmethoden.

3 Materialien und Methoden Reinkulturen von Isolaten wurden auf MPA ausgesät und nach Stunden der Inkubation wurde die Bakteriensuspension in Phosphat-Salzpuffer hergestellt. Die Kulturen wurden durch Gram und mikroskopisch angefärbt. Ausgewertete folgenden biochemischen Eigenschaften: Disposal Citrat, Malonat, Glucose, Lactose, Mannit, Saccharose, Inosit, Sorbit, Arabinose, Maltose, Phenylalanin, Bildung von Indol, Schwefelwasserstoff, atsetilmetilkarabinola (Reaktion Foges- Proskauer), die Gegenwart von beta-Galactosidase, Urease, Arginin-Decarboxylase und Lysin, Argininhydrolase. Kulturen wurden auf Katalase, Cytochromoxidase-Aktivitäten, die Bildung von Nitriten, die Synthese von Pigmenten, Antibiotika-Resistenz getestet, die kulturellen und morphologischen Eigenschaften untersucht. Beta-Galactosidase und tritofandezaminaznuyu glyukoronidaznuyu Aktivität getestet wurden auf Medium Uriselekt 4 (BioRad) Die DNA wurde durch fenolhloroformennym Ansicht auf der Grundlage der Sequenzierung von 16S ribosomalen Gen von RNAi-Fragmente des intergenischen Spacer von ribosomaler RNA und 16-23S mehr biochemischen, kulturelle und morphologischen Eigenschaften bestimmt isoliert.

4 Kulturelle Eigenschaften: Die gewachsenen Kulturen wuchsen nicht auf dem Endo-Medium, d.h. gehörte nicht zu Enterobakterien, wuchs auf Fleisch-Pepton-Agar und unter aeroben Bedingungen bei 37 ° C. Tactoriale Eigenschaften: Kultivierte Kulturen wurden mikroskopisch untersucht und wurden mit Gram angefärbt, wodurch festgestellt werden konnte, dass die erhaltenen Kulturen zu sporenbildenden Gr + -Stäbchen gehören

5 Studiendesign: DNA wurde aus gezüchteten Kulturen isoliert und die PCR mit universellen Primern gestartet, wodurch ein Fragment des 16S-Gens der ribosomalen RNA amplifiziert wurde

6 Eine Lösung mit einem Primer wird in 4 Teströhrchen verteilt, von denen jedes 4 Desoxynukleotide dATP, dTid, dTPP enthält (eines davon ist mit einem radioaktiven Isotop markiert) und eines von vier 2; es wird in allen Positionen der wachsenden Kettenmischung aktiviert, und nach seiner Befestigung hört das Kettenwachstum sofort auf. Als Ergebnis wird in jedem der vier Röhrchen unter Beteiligung von DNA-Polymerase ein einzigartiger Satz von Oligonukleotiden unterschiedlicher Länge gebildet, einschließlich der Primer-Sequenz. Als nächstes wird den Röhrchen Formalid zur Divergenz der Ketten zugesetzt und die Polyacrylatgelelektrophorese wird auf vier Bahnen durchgeführt. Die Radioautographie wird durchgeführt, wodurch Sie die Nukleinsäuresequenz des zu sequenzierenden DNA-Segments "lesen" können. In der Biochemie und Molekularbiologie wird die Elektrophorese verwendet, um Proteinmakromoleküle und Nukleinsäuren (sowie deren Fragmente) zu trennen. Es gibt viele Varianten dieser Methode. Diese Methode findet die breiteste Anwendung für die Trennung von Biomolekülgemischen in Fraktionen oder Einzelsubstanzen und wird in der Biochemie, Molekularbiologie, klinischen Diagnostik, Populationsbiologie (zur Untersuchung der genetischen Variabilität) und anderen Protein-Nukleinsäuren verwendet. Die Elektrophorese ist ein elektrokinetisches Phänomen der Bewegung von Partikeln einer dispergierten Phase (kolloidal oder Protein) Lösungen) in einem flüssigen oder gasförmigen Medium unter Einwirkung eines äußeren elektrischen Feldes Elektrokinetisches Phänomen des elektrischen Feldes Elektrophorese Studiendesign: PCR-Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt. Sanger-Methode

7 Ergebnisse unserer eigenen Forschung Abb.1 Ergebnisse der Kapillarelektrophorese eines Fragments des 16 S-Gens der ribosomalen RNA

8 Abbildung 2 Stammbaum basierend auf den Ergebnissen des Alignments eines Fragments des 16S-Gens von ribosomaler RNA

9 Ergebnisse eigener Forschung 3 Ergebnisse des Nukleotidsequenzvergleichs

10 Ergebnisse biochemischer Untersuchungen von Kulturen mit PBDE-Tests Biochemische Eigenschaften des B.licheniformis-Stammes: Citratverwendung ist negativ, Malonat ist negativ, Natriumcitrat + Glucose ist negativ, Lysin ist negativ, Arginin ist negativ, Phenylalanin ist negativ, Indol ist negativ, Acetylmethylsilabarabene ist negativ, Glukose-positiv, b-Galactosidase-positiv, Laktose-negativ, positiv, Sucrose positiv, Inosit positiv Ach ja, Sorbit ist positiv, Maltose ist positiv

11 Schlussfolgerung Die spezifische Identifizierung von Mikroorganismen auf der Grundlage der Sequenzierung kann der "Goldstandard" der Labordiagnostik sein. Die Genauigkeit der Methode ist jedoch durch die Genauigkeit und Vollständigkeit der GenBank-Datenbanken begrenzt und erfordert daher die zusätzliche Verwendung von Bestätigungstests.

16s Rna-Analyse

Biotechnology, 2005, №6, S. 3-11

Vorgeschlagen wird ein Verfahren zur Identifizierung von Mikroorganismen, basierend auf der Analyse des Längenpolymorphismus von Restriktionsfragmenten (PDFR) eines PCR-Produkts des 16S-RNA-Gens mit einer Länge von 1500 Nukleotiden. Ein Satz von 6 Restriktionsendonucleasen (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI und RsaI) wurde ausgewählt, was die Identifizierung einer Vielzahl von Mikroorganismen unter Verwendung von PCGF ermöglicht.
Vier Isolate der thermolabilen alkalischen Phosphatase wurden aus natürlichen Isolaten des Meerwassers isoliert. Die Analyse der PDFR für diese Stämme im Vergleich zu den berechneten Ergebnissen, die für die 16S-RNA-Gene verschiedener Mikroorganismen erhalten wurden, ermöglichte die Feststellung, dass die identifizierten Hersteller zur Gattung Alteromonas gehören.

Neben den traditionellen Methoden zur Identifizierung von Mikroorganismen anhand kultureller und morphologischer Merkmale sowie chemischer und biochemischer Reaktionen [1], wurden Methoden zum Bestimmen von Mikroorganismen auf der Grundlage eines Vergleichs von Nukleotidsequenzen verschiedener Mikroorganismengene [2-4] und Analyse des Polymorphismus der Längen von DNA-Restriktionsfragmenten, die als Ergebnis der Amplifikation einzelner Bakteriengene erhalten wurden [5, 6]. Die Gene, die für ribosomale 16S- und 23S-RNA kodieren, sind am besten für die Identifizierung geeignet, da sie in allen Bakterienzellen vorhanden sind und für die meisten Mikroorganismen gattungsspezifisch sind [7–9]. Die Verwendung eines DNA-Fragments, das sowohl das 16S- als auch das 23S-RNA-Gen und den variablen Spacer zwischen ihnen enthält, kann verwendet werden, um nahe verwandte Arten und Unterarten von Mikroorganismen zu identifizieren [10].

In diesem Artikel werden die Ergebnisse der FDPR-Analyse eines PCR-Produkts mit einer Länge von 1500 Nukleotiden für verschiedene Mikroorganismen vorgestellt. Es wurde gezeigt, dass die Verwendung der 6 Restriktionsendonukleasen Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI und RsaI die Mehrheit der Mikroorganismen zuverlässig identifiziert. In dieser Arbeit wurden 4 neue Hersteller von thermolabiler alkalischer Phosphatase identifiziert und mit der vorgeschlagenen Methode eine vergleichende Analyse von PDPR durchgeführt, um diese Mikroorganismen zu identifizieren. Aufgrund des Vergleichs wurde der Schluss gezogen, dass die gefundenen Produzenten zur Gattung Alteromonas gehören.

EXPERIMENTBEDINGUNGEN

Um die Hersteller von thermolabiler alkalischer Phosphatase zu identifizieren, wurden 50 μl Meerwasser auf der Nähragaroberfläche gemahlen und wie in [11] beschrieben analysiert. Die Produktion von Mikroorganismenbiomasse wurde durchgeführt, indem die Produzenten bei 20 ° C in einer Bouillon gezüchtet wurden, die 1% Trypton (AGS GmbH, Deutschland), 0,5% Hefeextrakt (dieselbe Firma) und Salzwasser (NaCl - 27,5, MgCl) enthielt₂ - 5 MgSO₄ - 2, CaCl₂ - 0,5, KCl - 1, FeSO & sub4; - 0,001 g / l [12]), pH 7,2 - 7,7. Die angeimpfte Brühe wurde in 200 ml in 700 ml-Schüttelkolben verteilt und 16 h bei 150 U / min geschüttelt.

Die Isolierung von chromosomaler DNA wurde gemäß der Methode von [13] durchgeführt.

Die Amplifikation des 16S-Gens der ribosomalen RNA wurde unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion durchgeführt, wie in [14] beschrieben.

Die Restriktionsreaktion der amplifizierten DNA wurde 4 Stunden bei 37 ° C in 20 μl der Reaktionsmischung mit 2 Einheiten durchgeführt. handeln Restrase Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI oder RsaI, hergestellt von NPO SibEnzyme, im entsprechenden Puffer. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 & mgr; l einer Stopplösung gestoppt, die 0,1 M EDTA, 0,05% Bromphenolblau und 40% Saccharose enthielt.

Die elektrophoretische Trennung der Produkte der restriktionsverstärkten DNA wurde in 2% Agarose (Sigma) in Trisacetatpuffer mit Ethidiumbromid (0,5 mg / l) bei 120 V für 4 Stunden durchgeführt.

Um die Länge von DNA-Fragmenten zu bestimmen, wurden DNA-Molekulargewichtsmarker verwendet (100 bp + 1,5 Kb DNA-Marker, NPO SibEnzyme). Die Bestimmung der Längen der erhaltenen Beschränkungen wurde mit dem Computerprogramm Gel Pro Analyzer, Version 4.0.00.001 durchgeführt. Die prozentuale Identität der Fragmentlängen wurde für jedes Paar Mikroorganismen berechnet, wobei die Restriktionsmuster für jedes Restriktionsenzym separat verglichen wurden. Beim Vergleich der Restriktionslängen wurden DNA-Fragmente als identisch betrachtet, deren Länge sich um nicht mehr als 5% unterschied.

Um die experimentellen Daten mit den veröffentlichten 16S-RNA-Gensequenzen zu vergleichen, wurde eine genetische Datenbank der sequenzierten Sequenzen verwendet.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Aus natürlichen Isolaten von Meerwasser isolierten wir vier Stämme, die thermolabile Phosphatase produzieren, die als 20, 27, 48 bezeichnet werden, und den zuvor beschriebenen Stamm [11], wobei traditionelle Methoden wie Alteromonas undina verwendet wurden. Um die Stämme zu identifizieren, die aus der Biomasse von Mikroorganismen, die in einem flüssigen Nährmedium unter Zusatz von Meersalzen gezüchtet wurden, erhalten wurden, wurde chromosomale DNA isoliert.
Als nächstes wurde chromosomale DNA in der Polymerasekettenreaktion verwendet, um das 16S-Gen der ribosomalen RNA zu amplifizieren. Das Amplifikationsprodukt wurde unabhängig mit 6 verschiedenen Restriktionsendonucleasen behandelt. Alle von uns verwendeten Restriktionen haben eine Tetranukleotid-Erkennungsstelle, die es erlaubt, 3 bis 8 DNA-Fragmente als Ergebnis der Spaltung des Amplifikationsprodukts zu erhalten, das eine Länge von etwa 1500 Nukleotiden hat. Die verwendeten Sse9I- und Tru9I-Restriktionsenzyme weisen die AATT- und TTAA-Erkennungsstellen auf, während die BsuRI- und MspI-Restriktionsenzyme die GGCC- und CCGG-Stellen durchschneiden. Die Restriktionsstellen BstMBI und RsaI, bzw. GATC und GTAC, enthalten alle vier Nukleotide. Eine solche Auswahl von Restriktionsendonukleasen sollte unserer Meinung nach Universalität bei der Identifizierung von Mikroorganismen mit sowohl AT-reichen als auch GC-reichen Genomen bieten. Quantitativ betrachten wir die Verwendung von genau 6 verschiedenen Restriktionsenzymen als optimal, da die Verwendung von 1 oder 3 Beschränkungen, wie in einer Reihe von Arbeiten vorgeschlagen [10, 15], keinen Polymorphismus bei der Identifizierung nahe verwandter Mikroorganismen erkennen lässt oder umgekehrt zu großen Unterschieden führt für eine oder mehrere zufällige Mutationen. Gleichzeitig führt die Verwendung von 10 verschiedenen Restriktionsendonucleasen nicht zu einer zusätzlichen Identifizierung des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus von DNA und ist eindeutig übermäßig [9].
1 zeigt computer-simulierte Muster der Restriktion von 16S-Genen für RNA, einem Satz von sechs von uns vorgeschlagenen Restriktionsenzymen (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI und RsaI). Die 16S-RNA-Gene stammen aus der genetischen Bank der sequenzierten Sequenzen. Die Wahl der Mikroorganismen war ziemlich zufällig. Alle Bakterien gehören verschiedenen Gattungen an und repräsentieren sowohl gramnegative als auch grampositive Mikroorganismen. Es ist ersichtlich, dass für alle Mikroorganismen ein einzigartiges Muster aus einer Reihe von Einschränkungen besteht. Die Anzahl der DNA-Fragmente variiert zwischen 23 und 30 (Fragmente mit einer Länge von weniger als 100 Basenpaaren werden nicht berücksichtigt). Die Ergebnisse der Berechnung der prozentualen Identität der Längen von DNA-Fragmenten (die als identisch betrachteten Beschränkungen sind nicht mehr als 5% verschieden) für verschiedene Paare von Mikroorganismen sind in Tabelle 1 dargestellt. Diese Tabelle zeigt nur einen Bruchteil der möglichen, in Fig. 1 gezeigten Mikroorganismenpaare. Die vorgestellten Vergleichsergebnisse sind jedoch ziemlich charakteristisch und lassen erkennen, dass die prozentuale Identität der Längen von DNA-Fragmenten für Vertreter verschiedener Gattungen von Mikroorganismen normalerweise zwischen 12 und 28% liegt. Somit zeigen die präsentierten Daten, dass das Restriktionsmuster der 16S-RNA-Gene mit dem von uns angebotenen Satz von Restriktionsenzymen als Basis für die Identifizierung der Gattung von Bakterienzellen dienen kann.

Abb. 1. Theoretisch berechnete Muster der elektrophoretischen Auftrennung von Amplifikationsprodukten von 16S-RNA-Genen nach Behandlung mit Restriktionsase Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), MspI (4), BstMBI (5) und RsaI (6). Verfolgt M - Molekulargewichtsmarker

Der Wert von 16S-RNA in der Systematik. Molekulare Hybridisierung von 16S-RNA.

Molekulare Hybridisierung von 16S-rRNA. Prokaryontisches Ribosom besteht aus 3 Untereinheiten, groß (23S), (5S) und (16S). Gen 16S rRNA besitzt die folgenden für die Phylogenie wichtigen Eigenschaften:

1. RNA-Ribosomen sind für verschiedene Spezies universell, wie die Ribosomen selbst. 2. Das 16S-rRNA-Molekül ist konservativ und für Änderungen im Verlauf der biologischen Evolution am wenigsten anfällig. Die Änderungsrate des 16S-rRNA-Gens in verschiedenen symbiotischen Bakterien betrug 2–4% der Nukleotidsubstitutionen über 60 Myr.3. Das 16S-rRNA-Gen weist sowohl ultrakonservierte als auch variable Regionen (Domänen) auf, was es ermöglicht, entfernte und enge Verwandtschaftsbeziehungen zu bewerten.4. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass rRNA-Cistrons nicht an interspezifischen genetischen Transferprozessen beteiligt sind.5. Die Größe des Gens (in Prokaryonten ist etwa 1550 bis 1640 bp lang) ist im Hinblick auf die Verringerung statistischer Fehler optimal. Eine vollständige Sequenz kann in einer Sequenzierung mit der Sanger-Methode bestimmt werden. Vergleich der Nukleotidverzeichnisse. Die Methode wurde Anfang der 80er Jahre angewendet und war in der Systematik der Bakterien von großer historischer Bedeutung. Gleichzeitig wurde das RNA-Molekül (16S-rRNA) mit Ribonuklease T behandelt, die das Molekül in Guaninreste spaltet. Die Größe der erhaltenen Fragmente betrug nicht mehr als 20 Nukleotide. Die resultierenden Oligonukleotide wurden durch zweidimensionale Elektrophorese getrennt, sequenziert und ein Katalog zusammengestellt, der das rRNA-Molekül spezifisch charakterisiert. Beim Vergleich von Katalogen wurden Fragmente mit einer Länge von mindestens 6 Nukleotiden berücksichtigt. Durch die Anwendung der Ähnlichkeitskoeffizienten zwischen Katalogen wurde zunächst ein gemeinsamer phylogenetischer Baum für Prokaryoten konstruiert. Riboprinting Die Methode basiert auf der Restriktionsanalyse von rRNA-Genen. Dafür wird Gesamt-DNA aus der Zelle isoliert. Es werden zwei Primer genommen, die homolog zu den hochkonservierten flankierenden Regionen des 16S-rRNA-Gens (kleine Untereinheit - ss-rDNA) sind, und die PCR wird durchgeführt. Die Fragmente werden mit mehreren Restriktionsendonucleasen prozessiert und die Restriktionsprodukte für jede der Endonucleasen werden zusammen mit dem Profil der Größenstandard-DNA auf einem Agarosegel aufgetrennt. Fragmentlängenpolymorphismus tritt auf, weil ein Teil der Restriktionsstellen in konservative Domänen des Gens und einige - in variable Domänen - fallen. In diesem Teil der Fragmente sind alle Arten in der Probe gemeinsam. Durch die Anzahl der gemeinsamen und unterschiedlichen Fragmente kann der genetische Abstand zwischen den Arten berechnet werden. Die Verwendung von 12 Restriktionsenzymen mit Erkennungsstellen von 4 Nukleotiden ermöglicht es, 10-15% der Länge des 16S-rRNA-Gens durch Analyse ohne Sequenzierung abzudecken.

Liebe Mikrobe

Valery Poroiko,
Promotion an der University of Chicago, Abteilung für Allgemeine Chirurgie
Popular Mechanics ı4, 2008

Noch vor hundert Jahren galten Mikroben im menschlichen Darm als Parasiten und Schädlinge. In den letzten Jahren wurde die menschliche Mikrobiota als eine Art Organ unseres Körpers bezeichnet, das für das normale Funktionieren des Körpers notwendig ist.

Seit Pasteurs Zeit ist bekannt, dass der menschliche Gastrointestinaltrakt im Wesentlichen ein Bioreaktor vom Fließtyp ist, in dem viele Mikroorganismen leben. Die Einstellung der Wissenschaftler zur Darmflora hat sich in dieser Zeit radikal verändert. Vor hundert Jahren bot der große Ilya Mechnikov, der Begründer der modernen Immunitätstheorie, für deren Schaffung er den Nobelpreis erhielt (für zwei Personen mit seinem unerbittlichen Gegner, nicht weniger großen Paul Ehrlich), sogar an, den Dickdarm als eine der Möglichkeiten zu verlängern, das Leben zu verlängern. Und denen, denen diese Maßnahme zu radikal erschien, empfahl ich, möglichst viel Kefir zu trinken, um schädliche, seiner Meinung nach, Mikroben mit nützlichen Milchsäurebakterien zu unterdrücken. Nach einem halben Jahrhundert hat sich der Kurs um 180 Grad geändert. Es stellte sich heraus, dass die normale Darmflora sowie die Haut und die Schleimhäute viele nützliche Funktionen ausüben - zum Beispiel unterdrückt sie die Vitalaktivität pathogener Mikroorganismen, die den Körper ständig angreifen. In den letzten Jahren sind die mutigsten Mikrobiologen sogar noch weiter gegangen und haben den Menschen und seine Mikroben zu einem einzigen symbiotischen Superorganismus erklärt.

Die Entwicklung molekularbiologischer Methoden brachte die Wissenschaftler auf eine neue Ebene des Verständnisses der Symbioseprozesse des Menschen und seiner Mikroflora, die gut untersucht waren und keine besonderen Überraschungen von weiteren Untersuchungen erwarteten. Das schnelle Wachstum der Geschwindigkeit und der Rückgang der Kosten für DNA-Sequenzierungsmethoden (Bestimmung der Nukleotidsequenz) und die parallele Zunahme der Leistungsfähigkeit von Personalcomputern und die Entwicklung des Internets ermöglichten die Analyse von Informationen über große Genomregionen. Nachdem die Chromosomen von Hunderten von einzelnen Bakterienarten entschlüsselt wurden, hat sich ein neuer Ansatz in der Genetik von Mikroorganismen entwickelt - populationsbasiert: Die Gene aller Bakterien eines bestimmten Gebiets gleichzeitig analysieren. Natürlich erwies sich die Population des „menschlichen Bioreaktors“ als eine der wichtigsten für die Untersuchung von mikrobiellen Populationen.

Die erste Arbeit, die zu einem völlig neuen Blick auf die intestinale Mikrobiota führte, wurde 1999 von einer Gruppe von Wissenschaftlern des National Institute for Agronomic Research (Frankreich) und der University of Reading (Großbritannien) veröffentlicht. Die Autoren beschlossen, die Methode der Sequenzierung von 16S-RNA-Genen für die Untersuchung der mikrobiellen Population des Darms anzuwenden (siehe Seitenleiste).

16S PHK - Bakterien-ID

Der erste Schritt bei der Bestimmung von Mikroorganismen ist deren Kultivierung auf Nährmedien. Aber einige Mikroben wollen in keinem Medium wachsen.

Moderne Techniken
Es war möglich, bisher unzugängliche, unkultivierte Bakterien zu untersuchen und mit der Entwicklung moderner Methoden der molekularbiologischen PCR (PCR), die es ermöglicht, Milliarden von exakten Kopien aus einem einzigen DNA-Segment zu gewinnen, die Klonierung ausgewählter Gene in Bakterienplasmiden und Sequenzierungstechniken. Nukleotide in ausreichender Menge zur Analyse erhalten. Ein idealer Marker für die Identifizierung von Mikroorganismen war das Gen, das für 16S ribosomale RNA kodiert (jede der beiden Untereinheiten des Ribosoms - Zellworkshops für die Proteinsynthese - besteht aus miteinander verflochtenen Proteinmolekülen und Ketten von Ribonukleinsäuren).

Perfekter Marker
Dieses Gen ist im Genom aller bekannten Bakterien und Archaeen, aber es fehlt in Eukaryoten und Viren, und wenn Sie seine charakteristische Nukleotidsequenz gefunden haben, handelt es sich definitiv um die Gene von Prokaryoten. Dieses Gen hat sowohl konservative Regionen, die für alle Prokaryoten gleich sind, als auch artspezifisch. Konservative Stellen dienen für die erste Stufe der Polymerasekettenreaktion - das Anbringen der Test-DNA an die Primer (Saatstellen der DNA, an die sich die untersuchte Nukleotidkette anfügen muss, um den Rest der Sequenz zu analysieren) und speziesspezifisch - um die Spezies zu bestimmen. Der Ähnlichkeitsgrad artenspezifischer Parzellen spiegelt die evolutionäre Verwandtschaft verschiedener Arten wider. Für die Klonierung und anschließende Analyse können Sie die ribosomale RNA selbst verwenden, die in einer Zelle in einer größeren Menge vorhanden ist als das entsprechende Gen. Die 16S-RNA-Nukleotidsequenzen aller bekannten Bakterien und Archaeen sind weithin verfügbar. Die identifizierten Sequenzen werden mit denen in den Datenbanken verglichen, um die Art der Bakterien zu identifizieren oder sie zu den nicht kultivierten Arten zu erklären.

Neue Taxonomie
Vor kurzem wurde die alte phänotypische Klassifizierung von Bakterien auf der Grundlage schlecht formalisierter Kriterien intensiv überarbeitet - vom Erscheinungsbild der Kolonien bis hin zu Lebensmittelpräferenzen und der Fähigkeit, mit verschiedenen Farbstoffen angefärbt zu werden. Die neue Systematik basiert auf molekularen Kriterien (16S-RNA) und wiederholt nur teilweise die phänotypische.

Was haben wir drin

Die kodierenden Sequenzen der 16S-RNA wurden direkt aus der "Umgebung" durch 125 mg des Menschen mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) extrahiert. Der Stuhl wurde in die Plasmide von Escherichia coli eingeführt (nicht weil er intestinal ist, sondern weil Escherichia coli einer der Favoriten ist.) die Arbeitstiere der Molekularbiologen) und wurden erneut aus einer Kultur vermehrter Bakterien isoliert. So wurde die 16S-RNA-Genbank aller Mikroorganismen in der Probe erstellt. Danach wurden 284 Klone zufällig ausgewählt und sequenziert. Es stellte sich heraus, dass nur 24% der erhaltenen 16S-RNA-Sequenzen zu vorbekannten Mikroorganismen gehörten. Seit mehr als hundert Jahren haben drei Viertel der Mikroflora im Darm jedes Menschen die Aufmerksamkeit der mit den Methoden der klassischen Mikrobiologie bewaffneten Forscher umgangen! Die Wissenschaftler konnten die Bedingungen für die Kultivierung dieser Bakterien einfach nicht finden, weil die launischsten Bewohner des Darms es ablehnten, auf traditionellen mikrobiologischen Medien zu wachsen.

Heute wurde mit molekularen Methoden festgestellt, dass 10 von 70 großen Bakterien-Taxa in der Mikrobiota eines Erwachsenen vertreten sind. Etwa 90% unserer Mikroben gehören zu den Firmicutes-Typen (z. B. sind die bekannten Laktobakterien die Hauptverursacher der Milchsäuerung) und Bacteroidetes sind obligatorische Anaerobier (Organismen, die nur unter Ausschluss von Sauerstoff leben können), die häufig als Indikator für Verschmutzung verwendet werden natürliches Wasser Abwasser. Die restlichen 10% der Bevölkerung teilen sich Proteobacteria taxa (ua E. coli), Actinobacteria (das Antibiotikum Streptomycin wurde aus einem Typ von Actinomyceten isoliert), Fusobacteria (häufige Bewohner der Mundhöhle und häufige Ursache für Parodontitis), Verrucomicrobia (kürzlich) Es wurde festgestellt, dass die geothermische Quelle die Form dieser Mikroben hat, die sich von Methan ernähren, das aufgrund der vitalen Aktivität anderer Mikroorganismen im Darm reichlich vorhanden ist.) Cyanobakterien (sie werden bis heute häufig als „Blau-Grünalgen“ bezeichnet), Spirochaetes (zum Glück) nd, nicht blass), Synergistes und VadinBE97 (welche Art von Tieren, fragen die Schöpfer der neuen Taxonomie der Prokaryoten).

Mikrobiell in uns mehr als menschlich

Zu diesem Zweck werden die am stärksten automatisierten, computergesteuerten und leistungsfähigen DNA-Sequenzierungstechnologien verwendet, die es ermöglichen, kurze Nukleotidsequenzen zu analysieren, ein Puzzle aus mehreren übereinstimmenden Buchstaben an den Enden dieser Abschnitte zusammenzusetzen, dieses Verfahren für jedes Stück des Genoms wiederholt zu wiederholen und die Entschlüsselung einzelner Gene und Chromosomen zu erhalten mit Geschwindigkeiten von bis zu 14 Millionen Nukleotiden pro Stunde - um Größenordnungen schneller als noch vor einigen Jahren. So wurde festgestellt, dass die intestinale Mikrobiota etwa 100 Billionen Bakterienzellen aufweist - etwa zehnmal mehr als die Gesamtzahl der Zellen im menschlichen Körper.

Die Menge der Gene, aus denen das bakterielle Metagenom besteht, ist etwa hundertmal größer als die Menge der Gene des menschlichen Körpers. Wenn wir über das Volumen biochemischer Reaktionen sprechen, die in der Mikrobenpopulation stattfinden, ist es wieder ein Vielfaches höher als das Volumen biochemischer Reaktionen im menschlichen Körper.

Der bakterielle „Reaktor“ implementiert metabolische Ketten im Organismus des Wirts, die er nicht selbst tragen kann - zum Beispiel die Synthese von Vitaminen und ihren Vorläufern, den Abbau bestimmter Toxine, den Abbau von Cellulose zu verdaulichen Polysacchariden (bei Wiederkäuern) usw.

Vom Säuglingsalter bis zum Alter

Trotz der Tatsache, dass die Artenzusammensetzung der Darmmikroorganismen eher eintönig ist, kann das Mengenverhältnis von Vertretern bestimmter systematischer Gruppen in den Mikrobiota verschiedener Menschen stark variieren. Aber wie sieht die normale Darmflora aus und wie werden sie gebildet?

Diese Frage wurde 2007 in einer Arbeit einer Gruppe amerikanischer Biologen unter der Leitung von Patrick Brown von der Stanford University beantwortet. Sie haben die Entstehung von Mikrobiota bei 14 Neugeborenen im ersten Lebensjahr verfolgt. Die Autoren konnten mehrere Quellen der Kolonisation des Gastrointestinaltrakts feststellen. Die Mikrobiota der Babys hatten Ähnlichkeiten mit der Mikroflora der Mutter: Vaginal-, Fäkalien- oder Mikroflora von Muttermilchproben. Je nach Besiedlungsquelle waren im ersten Lebensjahr verschiedene Arten in der Darmflora von Säuglingen vorherrschend. Diese Unterschiede blieben während des gesamten Untersuchungszeitraums signifikant, aber im Alter von einem Jahr machte sich die Bildung der Mikrobiota für Erwachsene bemerkbar. Interessante Daten wurden am Beispiel eines Zwillingspaares gewonnen. Die Mikroflora in ihnen war in ihrer Zusammensetzung fast identisch und änderte sich auf dieselbe Weise. Dieser Befund zeigte die enorme Rolle der menschlichen Komponente des Paares Mikrobiota-Wirt bei der Bildung der Darmflora-Population. Für die Reinheit des Experiments wäre es natürlich notwendig, die Babys noch im Krankenhaus zu trennen (übrigens eine wunderbare Geschichte für einen indischen Film! Über die Jahre lernen sich die Zwillinge durch Mikrofloraanalysen kennen.). Daten aus anderen Studien haben jedoch die Annahme bestätigt, dass individuelle, einschließlich erbliche, Merkmale der menschlichen Biochemie einen großen Einfluss auf die Zusammensetzung ihrer Mikrobiota haben.

Dünn und dick

Studien, die im Labor von Jeffrey Gordon (School of Medicine an der University of Washington, St. Louis, Missouri) durchgeführt wurden, erlaubten es, die Artenvielfalt der Bakterien des Gastrointestinaltrakts mit der Ernährung und den metabolischen Merkmalen des Individuums in Verbindung zu bringen. Die Ergebnisse des Experiments wurden in der Dezember-Ausgabe des Nature-Magazins veröffentlicht. In dem einjährigen Experiment wurde vorgeschlagen, eine Korrelation zwischen dem Übergewicht beim Menschen und der Zusammensetzung der mikrobiellen Population des Darms herzustellen. Ein Dutzend dicke Leute, die sich einverstanden erklärten, ihren Bauch auf den Altar der Wissenschaft zu legen, wurden in zwei Gruppen aufgeteilt. Einer nahm eine fettarme Diät, der andere eine Low-Carb-Diät. Alle Freiwilligen nahmen an Gewicht ab und veränderten gleichzeitig das Verhältnis der beiden Hauptgruppen der Darmmikroorganismen: Die Anzahl der Firmicutes-Zellen nahm ab und die Anzahl der Bacteroidetes nahm dagegen zu. Bei einer fettarmen Diät machte sich eine solche Änderung später bemerkbar - nachdem die Patienten 6% ihres Gewichts verloren hatten, und bei einer kohlenhydratarmen Diät - nachdem die ersten Kilogramm (2% ihres ursprünglichen Körpergewichts) abgenommen hatten. In diesem Fall war die Änderung der Zusammensetzung der Mikroflora um so ausgeprägter, je geringer das Gewicht der Versuchsteilnehmer wurde.

Kampf gegen Fettleibigkeit

Die Ergebnisse der weiteren Studie der Wissenschaftler über Veränderungen des symbiotischen Maus-Mikrobenorganismus (siehe Kasten "Getestet an Mäusen") bestätigten die Hypothese, dass die Mikrobiota von adipösen Individuen zu einer tieferen Verarbeitung von Nahrungsmitteln beiträgt. Ein Vergleich von Stuhl-DNA-Proben aus fettleibigen und normalen Mäusen hat gezeigt, dass Fettleibigkeitsmikrobiome mit Enzymgenen gesättigt sind, die einen effizienteren Abbau von Polysacchariden ermöglichen. Der Darm von fetten Mäusen enthielt große Mengen an Fermentationsendprodukten - Verbindungen von Essigsäure und Buttersäure, was auf eine tiefere Verarbeitung von Nahrungsbestandteilen hindeutet. Kalorimetrisch (vom Wort „Kalorien“!) Die Analyse der Stuhlproben von Mäusen bestätigte dies: Der Stuhl von ob / ob-Mäusen enthielt weniger Kalorien als Wildtyp-Mäuse, die keine Energie aus der Nahrung absorbierten.

Zusätzlich zu den wichtigen Informationen über die „mikrobielle“ Komponente der Fettleibigkeit konnten die Autoren die grundlegende Ähnlichkeit der Mikroflora bei übergewichtigen Menschen und Mäusen aufzeigen, was neue Perspektiven bei der Untersuchung des Problems des Übergewichts und möglicherweise die Lösung dieses Problems durch „Transplantation“ gesunder Mikroflora oder deren Bildung bei Patienten eröffnet fettleibig

Getestet an Mäusen

Und mit Erschöpfung

Die Tatsache, dass die Mikrobiota den Stoffwechsel des Wirts steuern kann, ist nicht mehr zweifelhaft. Das Forschungslabor Gordon, das sich dem Problem des Übergewichts widmet, erlaubte es, eine Brücke zur Behandlung von Stoffwechselkrankheiten zu schlagen. Darunter sind solche Arten der allgemeinen Erschöpfung, die Kinder in ein bis vier Jahren in armen Ländern mit tropischem Klima betreffen, wie Marasmus (dieses Wort hat nur eine sprachliche Beziehung zu Marasmus: Griechisch Marasmoz bedeutet wörtlich Erschöpfung, Aussterben) und Kwashiorkor (in der Sprache eines der Stämme) Ghana kwashiorkor - "roter Junge"). Das Auftreten von Krankheiten ist mit einem Mangel an Proteinen und Vitaminen während des Übergangs vom Stillen auf die Ernährung von Erwachsenen verbunden. Krankheiten betreffen jedoch selektiv Kinder, deren Geschwister beim Übergang zur traditionellen Ernährung der Region keine Probleme hatten. Studien haben gezeigt, dass sich die Darmflora von kranken Kindern sehr stark von der Mikroflora ihrer Eltern sowie von der Mikroflora gesunder Brüder und Schwestern unterscheidet. Zunächst wurde das nahezu vollständige Fehlen von Bacteroidetes in der Darmpopulation und die Dominanz seltener Arten, die zu den Arten von Proteobakterien und Fusobakterien gehören, festgestellt. Nachdem die kranken Kinder (sorgfältig, um nicht überdosiert zu werden!) Intensiv mit Eiweiß gefüttert wurden, sah ihre Mikrobiota wie bei Verwandten mit der Prävalenz von Bactrotetes und Firmicutes aus.

Jüngste Studien haben nicht nur das derzeitige Verständnis der menschlichen Darmflora grundlegend verändert, sondern auch zur Entstehung eines Konzepts beigetragen, das die Darmmikrobiota als zusätzliches mehrzelliges menschliches "Organ" betrachtet. Ein Organ, das aus verschiedenen Zelllinien besteht, die sowohl untereinander als auch mit dem Wirtsorganismus kommunizieren können. Der Körper, der Energieflüsse umverteilt, wichtige physiologische Reaktionen durchführt, sich unter dem Einfluss der Umgebung verändert und sich selbst regeneriert, wenn Änderungen durch äußere Bedingungen hervorgerufen werden. Die Fortsetzung des Studiums des "bakteriellen Organs" kann und sollte zu einem Verständnis der Funktionsgesetze, der Offenlegung seiner subtilen Verbindungen mit dem Wirtsorganismus und infolgedessen zur Entstehung neuer Methoden zur Bekämpfung menschlicher Erkrankungen durch gezielte Behandlung von Funktionsstörungen beider Komponenten des Metaorganismus führen.

16s Rna-Analyse

Ribosomale Ribonukleinsäuren (rRNA) sind mehrere RNA-Moleküle, die die Basis des Ribosoms bilden. Die Hauptfunktion von rRNA besteht darin, den Translationsprozess auszuführen - das Lesen von Informationen aus mRNA mithilfe von tRNA-Adaptormolekülen und die Katalyse der Bildung von Peptidbindungen zwischen an tRNA gebundenen Aminosäuren.

Inhalt

Ribosomale Subpartikel und rRNA-Nomenklatur

Auf elektronenmikroskopischen Aufnahmen intakter Ribosomen ist festzustellen, dass sie aus zwei Subpartikeln unterschiedlicher Größe bestehen.

Das Massenverhältnis der Subpartikel beträgt

2: 1; Die Massen wiederum werden in direkt gemessenen Sedimentationskonstanten (Sedimentationsrate in Svedberg-Einheiten, S) während der Ultrazentrifugation ausgedrückt. Dieser Parameter bildete die Grundlage der rRNA-Nomenklatur und der Ribosomen und ribosomalen Subpartikel: Die Typenbezeichnungen werden verwendet

Beispielsweise wird die ribosomale RNA von Prokaryoten mit einem Sedimentationskoeffizienten von 16 Svedberg-Einheiten als 16S-rRNA bezeichnet.

Da die Sedimentationskoeffizienten nicht nur vom Molekulargewicht, sondern auch von der Form der Partikel abhängen, sind die Sedimentationskoeffizienten während der Dissoziation nicht additiv, beispielsweise bakterielle Ribosomen mit einer molekularen Masse

3 * 10 6 Dalton hat einen Sedimentationskoeffizienten von 70S, bezeichnet als 70S und dissoziiert in die Untereinheiten 50S und 30S:

Ribosomale Untereinheiten enthalten jeweils ein langes rRNA-Molekül, dessen Masse ist

1/2 - 2/3 der Masse des ribosomalen Subpartikels, so enthält die 50S-Untereinheit im Fall von bakteriellen 70S-Ribosomen 23S-rRNA (Länge

3000 Nukleotide) und die 30S-Untereinheit enthält 16S-rRNA (Länge

1500 Nukleotide); Neben der "langen" rRNA enthält die große ribosomale Untereinheit auch eine oder zwei "kurze" rRNA (5S-rRNA bakterieller ribosomaler Untereinheiten 50S oder 5S und 5.8S-rRNA der größeren ribosomalen Untereinheiten von Eukaryoten).

Synthesis

Ribosomale RNA macht einen großen Anteil (bis zu 80%) der gesamten zellulären RNA aus, eine solche Menge an rRNA erfordert eine intensive Transkription ihrer kodierenden Gene. Diese Intensität wird durch eine große Anzahl von Kopien von Genen bereitgestellt, die für rRNA kodieren: In Eukaryonten gibt es mehrere Hundert (

200 in Hefe) bis Zehntausende (für verschiedene Baumwolllinien wurden 50-120.000 Kopien angegeben) von Genen, die in Reihen von Tandemwiederholungen organisiert waren.

Beim Menschen sind die Gene, die für rRNA kodieren, auch in Gruppen von Tandem-Repeats organisiert, die sich in den zentralen Bereichen des kurzen Arms von Chromosom 13, 14, 15, 21 und 22 befinden.

Sie werden durch RNA-Polymerase I als langes Molekül aus prä-ribosomaler RNA synthetisiert, die in separate RNAs geschnitten wird, die die Basis des Ribosoms bilden. In Bakterien und Archaeen enthält das anfängliche Transkript normalerweise 16S-, 23S- und 5S-rRNA, zwischen denen die Prä-rRNA-Sequenzen deletiert sind. Zwischen den 16S- und 23S-rRNA-Genen befinden sich normalerweise ein oder mehrere tRNA-Gene. In E. coli hat das anfängliche Transkript einer solchen Gruppe von Genen die folgende Sequenz:

(16S rRNA) - (1-2 tRNA) - (23S rRNA) - (5S rRNA) - (0-2 tRNA)

Ein solches Transkript wird durch das Enzym Ribonuclease III in Fragmente von prä-rRNA und tRNA gespalten.

In Eukaryoten werden 18S-, 5.8S- und 25/28-rRNA mit RNA-Polymerase I co-transkribiert, während das 5S-rRNA-Gen mit RNA-Polymerase III transkribiert wird.

In Eukaryoten sind die Konzentrationsstellen der Gene, die für rRNA kodieren, aufgrund der Anhäufung von Ribosomen-Untereinheiten um sie herum im Zellkern gut sichtbar, die sofort zusammengefügt werden. Diese Cluster sind gut mit zytologischen Farbstoffen angefärbt und werden als Nukleolus bezeichnet. Dementsprechend ist das Vorhandensein von Nukleolen nicht für alle Phasen des Zellzyklus charakteristisch: Während der Zellteilung in der Prophase dissoziiert der Nukleolus, da die rRNA-Synthese am Ende der Telophase suspendiert und wieder gebildet wird, wenn die rRNA-Synthese wieder aufgenommen wird.

Vergleichende Analyse von Pro und eukaryotischer rRNA

Ribosomale RNAs (wie die Ribosomen) von Prokaryoten und Eukaryoten unterscheiden sich voneinander, obwohl sie eine signifikante Ähnlichkeit zwischen den Bereichen der Sequenzen aufweisen. Das prokaryontische 70S-Ribosom besteht aus einer großen 50S-Untereinheit (auf der Basis von zwei rRNA-Molekülen - 5S und 23S) und einer kleinen 30S-Untereinheit (auf Basis von 16S-rRNA). Das eukaryotische 80S-Ribosom besteht aus einer großen 60S-Untereinheit (aufgebaut auf der Basis von drei rRNA-Molekülen - 5S, 5.8S und 28S) und einer kleinen 40S-Untereinheit (aufgebaut auf der Basis von 18S-rRNA).

Sequenzinformationen verwenden

Informationen über die rRNA eines bestimmten Organismus werden in der Medizin und in der Evolutionsbiologie verwendet.

• Das rRNA-Gen ist eines der konservativsten (am wenigsten variablen) Gene. Daher können die systematische Position des Organismus und der Zeitpunkt der Divergenz mit nahen Spezies auf der Grundlage einer Analyse von Ähnlichkeiten und Unterschieden in rRNA-Sequenzen bestimmt werden.
• rRNA ist ein Ziel für eine große Anzahl von Antibiotika, von denen einige in der klinischen Praxis verwendet werden, sowohl zur Unterdrückung des Wachstums von Bakterien (Antibiotika, die an das prokaryotische Ribosom binden) als auch zur Behandlung von menschlichen Krankheiten (Antibiotika, die an das eukaryotische Ribosom binden). Die erste Gruppe umfasst Chloramphenicol, Erythromycin, Kasugamycin, Microcoxin, Spectinomycin, Streptomycin, Thiostrepton. Bis zum zweiten Hygromycin B Paromomycin.